3454 ИЗУЧЕНИЕ МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ РАСТРОВЫМ ЭЛЕКТРОННЫМ МИКРОСКОПОМ

Цель работы: изучение методик исследования поверхностей биологических объектов во вторичных и отраженных электронах при использовании растрового электронного микроскопа (РЭМ), ознакомление со способами интерпретации микрофотографий.

Приборы и оборудование: растровый электронный микроскоп JSM-50A, рентгеновский микроанализатор JXA-50A.

 

ЭЛЕМЕНТЫ ТЕОРИИ И МЕТОД ЭКСПЕРИМЕНТА

 

Процесс формирования изображения в РЭМ, под которым понимают отображение области образца на экране электронно-лучевой трубки (ЭЛТ), осуществляется с помощью нескольких систем и устройств, основными из которых являются система сканирования, детекторы сигналов, усилители и видеоконтрольное устройство. Более детально с этим процессом можно ознакомиться в работах [1-3]. Отметим, что каждому положению электронного зонда на образце соответствует единственное положение пучка ЭЛТ. Таким образом, формирование изображения в РЭМ осуществляется за счет операции отображения, которая преобразует информацию из пространства объекта в пространство ЭЛТ.

Существуют различные механизмы формирования контраста, под которыми понимают изменение интенсивности на изображении [1-3]. В качестве меры контраста С используют следующую величину:

,                                                        (1)

где Smax и Smin – сигналы, регистрируемые в любых двух точках сканирования. Из определения (1) следует, что 0£С£1.

В контрасте заключается информация, которая связана со свойствами излучаемого объекта. Поэтому первоначально он обусловлен явлениями, происходящими внутри образца (например, рассеяние атомами различного рода) или в непосредственной близости от поверхности (например, за счет электрического и магнитного полей над поверхностью образца). Детекторы, используемые для регистрации сигналов, могут модифицировать контраст, но не увеличить объем информации, содержащейся в сигнале.

В работе рассматриваются два основных механизма формирования контраста, с которыми встречаются при исследовании биологических объектов: контраст, зависящий от атомного номера элемента (или контраст от состава), и топографический контраст, обусловленный неровностями поверхности образца.

Контраст, зависящий от атомного номера элемента (контраст от состава). Вначале рассмотрим контраст от состава при регистрации изображения в отраженных электронах [1, 2, 4]. Коэффициент отражения электронов h определяется следующим выражением:

,                                                          (2)

где nо.э. – число отраженных электронов; nз. – число электронов, падающих на образец; iо.э. и iз. – токи, которые соответствуют отраженным электронам и зонду.

Как следует из литературы, коэффициент отражения h зависит от атомного номера (возрастает при его увеличении), практически не зависит от энергии зонда, изменяется в зависимости от угла наклона образца q (медленно возрастает при увеличении угла q от 0 до ~ 200, при углах >300 растет быстрее и при скользящем падении, что соответствует q = 900, стремится к единице). Поэтому различия, наблюдаемые в величине h с изменением атомного номера Z при нормальном падении, уменьшаются при больших углах наклона, поскольку h для всех элементов стремится к одной и той же величине.

Для интерпретации изображений в отраженных электронах необходимо также учитывать угловое и пространственное распределение вылетевших из образца отраженных электронов и их глубину выхода. Так, если угол q = 00, то максимальное число отраженных электронов движется в направлении, обратном направлению движения электронного пучка, причем их число уменьшается до нуля, когда q возрастает до 900. Для пучка, падающего нормально на плоский образец, распределение отраженных электронов по диаметру эмитирующей области симметрично и имеет максимум в точке падения пучка. При этом для образцов с большим Z диаметр распределения меньше, а центральный максимум выше. Если образец наклонен, пространственное распределение отраженных электронов становится асимметричным относительно оси наклона, а максимум смещается дальше по поверхности от точки падения пучка.

Глубина выхода, с которой переносится информация отраженными электронами, составляет приблизительно 0,3 от длины пробега, рассчитанной по модели Канайти-Окаямы:

, мкм,                                         (3)

где RКО –  максимальная длина пробега электрона;  Е0 –  энергия электронов пучка, кэВ; А – молярная масса, г/моль; r – плотность, г/см3; Z – атомный номер мишени. Значения RКО, мкм, для некоторых элементов приведены в таблице [2].

 

Мишень

10 кэВ

20 кэВ

Алюминий

1,32

4,2

Медь

0,46

1,47

Золото

0,27

0,86

 

Пусть образец представляет собой аморфное твердое тело из чистого элемента и имеет толщину, которую можно считать бесконечной (то есть значительно превышающей длину пробега электрона при данной энергии). На рис. 1,а представлена схема потоков электронов, испускаемых при двух положениях зонда, взаимодействующего с указанным образцом. Если не учитывать статистических флуктуаций и исключить краевые эффекты, то в указанных условиях сигналы, обусловленные отраженными и вторичными электронами [1-3], будут одинаковыми (обозначения на рис. 1: nо.э. – количество отраженных электронов; nв.э. – количество вторичных электронов образца).

Аналогичная ситуация будет наблюдаться и во всех остальных точках образца. Поэтому в соответствии с уравнением (1) в этом случае С = 0, то есть контраст отсутствует. На рис. 1,б представлена схема, аналогичная описанной выше, для более сложного образца, состоящего из двух областей, содержащих различные чистые элементы 1 и 2. Для определенности полагаем, что Z2>Z1. Потоки электронов, испускаемых в положениях 1 и 2 зонда, должны различаться из-за того, что число отраженных и вторичных электронов зависит от атомного номера.

Число вторичных электронов слабо зависит от атомного номера для энергий пучка свыше 10 кэВ. Поэтому будем считать, что вторичная эмиссия примерно одинакова для обоих элементов. Следовательно, если рассматривать только отраженные электроны, разница в сигналах в положениях 1 и 2 приведет к возникновению контраста, который будет равен:

.    (4)

В уравнении (4) учтено, что при использовании детектора типа сцинтиллятор-фотоумножи­тель или твердотельного детектора, сигнал пропорционален коэффициенту отражения. Указанный механизм контраста известен как «контраст, зависящий от атомного номера» (а также «контраст от состава», или «Z-контраст»).

Отметим основные характеристики контраста, зависящего от атомного номера, являющиеся следствием свойств процесса отражения.

1. Области с высоким средним атомным номером выглядят более яркими из-за возрастания h с Z.

2. Если элементы отличаются по Z на единицу (DZ=1), то они создают слабый контраст, который также уменьшается с ростом Z, например контраст составляет 6,7 % для элементов Al (Z=13) и Si (Z=14), тогда как для Au (Z=79) и Pt (Z=78) он уменьшается до 0,41 %. Если разница в Z большая, контраст сильно увеличивается, например элементы Al и Au создают контраст около 0,69 (69 %).

3. На контраст влияет установка детектора по отношению к образцу. Более эффективным для данного контраста считается детектор, установленный над образцом под большим углом выхода, если сравнивать его с детектором, расположенным под малым углом выхода.

4. Так как выход отраженных электронов зависит от энергии электронов зонда, то детектор, имеющий чувствительность по энергии (например, твердотельный детектор), будет регистрировать дополнительное увеличение контраста.

5. Детекторы электронов такие, как твердотельный детектор или детектор Эверхарта-Торнли (Э-Т) могут существенно изменять контраст по сравнению с предсказываемым из-за особых свойств (зависимость от энергии, эффективность сбора и т.д.), характерных указанным детекторам.

В режиме вторичных электронов контраст от состава образца, как правило, не наблюдается. Это обусловлено, во-первых, тем, что коэффициент вторичной электронной эмиссии слабо зависит от атомного номера и, во-вторых, определяется условиями на поверхности образца. Так, напыленная проводящая пленка или слой загрязнения на поверхности образца могут полностью уничтожить контраст от атомного номера при регистрации картины во вторичных электронах.

Из сказанного выше можно заключить, что контраст является сложной функцией свойств объекта, вторичных и отраженных электронов, несущих информацию, и детектора. Выделяют различные составляющие контраста:

а) компонента, обусловленная количеством вылетающих электронов;

б) компонента, связанная с траекториями электронов после их выхода из образца;

в) энергетическая компонента.

Топографический контраст. Выход вторичных и отраженных электронов зависит от угла падения пучка на образец. Если поверхность неровная, то угол падения будет меняться, и это приведет к контрасту, который называют топографическим.

Вначале рассмотрим формирование топографического контраста в режиме отраженных электронов с детектором Э-Т. Чтобы исключить вторичные электроны, на цилиндр Фарадея детектора Э-Т подается отрицательное напряжение (рис. 2,а). В этом случае, как видно из рис. 2,а, детектор расположен с одной стороны (как говорят, направлен на образец анизотропно), имеет малый телесный угол сбора отраженных электронов (поэтому детектируются только электроны, рассеянные точно в направлении детектора) и расположен под большим углом к пучку, обычно более 500 (то есть угол выхода мал). В таких условиях изображение образца со случайно ориентированными поверхностями характеризуется очень резким контрастом и состоит в основном из белых и черных областей, а участков с промежуточными уровнями серого наблюдается очень мало. С учетом сказанного выше яркими будут выглядеть поверхности б и г (причем г будет ярче, чем б) на рис. 2,а, тогда как поверхности а и в будут практически черными.

В некоторых случаях полезно рассмотреть светооптическую аналогию изображения, получаемого в РЭМ, так как существует значительное сходство между изображениями в РЭМ и изображениями шероховатых объектов, которые освещены светом и наблюдаются глазом. Так изображение, соответствующее рис. 2,а, эквивалентно тому, которое можно увидеть, если освещать шероховатый объект направленным источником света (косое освещение) и наблюдать образец сверху вниз (рис. 2,б). Тогда области, направленные к источнику света, будут выглядеть светлыми, а обращенные в сторону от источника – почти черными.

Если цилиндр Фарадея находится под положительным напряжением, то детектором Э-Т регистрируются вторичные электроны (рис. 3,а). Сбор отраженных электронов осуществляется так же, как и в предыдущем случае. Будем считать, что вторичные электроны испускаются со всех облучаемых пучком поверхностей, причем их выход резко возрастает с ростом локального угла наклона. По результатам экспериментов установлено, что коэффициент вторичной электронной эмиссии d возрастает с увеличением угла наклона образца по закону секанса [1, 2]

,                                                       (5)

где d0 – коэффициент вторичной электронной эмиссии при нормальном падении пучка на образец. Если продифференцировать уравнение (5), то получится разница в коэффициенте выхода вторичных электронов dd для двух поверхностей, имеющих элементарное различие в углах наклона dq:

,                                               (6)